2 英文參考
Requirements of mycobactericidal evaluation for disinfectant in laboratory
ICS 11.080
C 59
中華人民共和國衛生行業標準 WS/T 327—2011《消毒劑殺滅分枝桿菌實驗評價要求》（Requirements of mycobactericidal evaluation for disinfectant in laboratory）由中華人民共和國衛生部於2011年04月12日發佈，自2011年09月30日起實施。
3 前言
根據《中華人民共和國傳染病防治法》制定本標準。
本標準爲推薦性標準。
本標準的附錄A和附錄B爲規範性附錄。
本標準由衛生部消毒標準專業委員會提出。
本標準由中華人民共和國衛生部批准。
本標準負責起草單位：四川大學華西公共衛生學院、中國疾病預防控制中心。本標準主要起草人：張朝武、李新武、王國慶。
5 2 規範性引用文件
下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用於本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本文件。
GB/T 4789.28 食品衛生微生物學檢驗 染色法、培養基和試劑
消毒技術規範 中華人民共和國衛生部
6 3 術語和定義
《消毒技術規範》中確立的有關定義和術語適用於本文件。
7 4 試劑與儀器
7.1 4.1 試驗菌株
龜分枝桿菌膿腫亞種CMCC（B）93326（ATCC 19977）。
7.2 4.2 培養基
4.2.2 改良羅氏培養基（見附錄A）。
7.3 4.3 其他試劑
4.3.1 中和劑 根據消毒劑種類選擇並經中和劑鑑定試驗（見附錄B）合格者。
4.3.2 稀釋液 含0.1%胰蛋白腖的生理鹽水（見附錄A）。
4.3.3 標準硬水（見附錄A）。
4.3.4 有機干擾物（見附錄A）。
7.4 4.4 儀器設備
4.4.1 恆溫培養箱。
4.4.2 恆溫水浴箱。
4.4.3 計時器。
4.4.4 電動混和器。
4.4.5 刻度吸管（0.1 mL、1.0 mL、5.0 mL）或移液器。
4.4.6 生物安全Ⅱ級實驗室（BSL-2）。
8 5 龜分枝桿菌膿腫亞種菌懸液和菌片的製備
8.1 5.1 菌懸液的製備
5.1.1 取凍幹菌種管，以無菌操作打開，用毛細吸管吸加適量營養肉湯（應符合GB/T 4789.28要求，見附錄A）於管中，輕柔吹吸數次，使菌種融化分散。取含5.0 mL～10.0 mL營養肉湯或蘇通綜合液體培養基試管，滴入少許菌種懸液，置37℃培養18 h～24 h。用接種環取第1代培養的菌劃線接種於商品化分枝桿菌專用複合瓊脂培養基平皿上，於37℃培養72 h。挑取上述第2代培養物中典型菌落，接種商品化分枝桿菌專用複合瓊脂培養基斜面，於37℃培養72 h，即爲第3代培養物。密封後，在4℃保存，時間不超過6周。
5.1.2 試驗時取第3代斜面培養物，在商品化分枝桿菌專用複合瓊脂培養基斜面上連續傳代，培養方法與第3代相同。取第5代～第6代的72 h新鮮培養物，用5.0 mL吸管吸取3.0 mL～5.0 mL稀釋液加入斜面試管內，反覆吹吸，洗下菌苔。隨後，用5.0 mL吸管將洗液移至一含有6 g～7 g玻璃珠的無菌圓錐底試管中，用電動混合器混合至少5 min。然後將菌液吸入到另一試管內製成菌懸液。菌懸液保存在4℃冰箱內備用。當天使用不得過夜。
5.1.3 將製成的菌懸液，進行活菌培養計數，按其結果用稀釋液稀釋至所需濃度（懸液定量殺滅試驗時回收菌數爲1×107CFU/mL～5×107CFU/mL）。
8.2 5.2 染菌載體（菌片）的製備
8.2.1 5.2.1 載體
5.2.1.1 載體應根據消毒對象選擇，常用的有金屬、玻璃、濾紙、線、棉布等。根據消毒對象選擇適宜材料載體作爲代表。載體可以爲方形，大小爲10 mm×10 mm。當以金屬片爲載體時，可用12 mm直徑圓形金屬片（厚0.5 mm）。
5.2.1.2 所用載體（除濾紙片外）於染菌前，應進行脫脂處理。脫脂方法如下：
b） 以自來水洗淨；
c） 用蒸餾水煮沸10 min；
e） 晾乾、熨平備用。
5.2.1.3 布片用白平紋棉布製作。在剪開前，先將脫脂的布塊按載體規定的大小，抽去邊緣一週的經緯紗各一根，再按抽紗痕剪開。此法制成的載體大小一致，且無毛邊。金屬片以不鏽鋼製作，紙片以新華濾紙製作。
8.2.2 5.2.2 菌片的製備
取上述5.1.2所獲得的龜分枝桿菌膿腫亞種菌懸液，用稀釋液稀釋至2×108CFU/mL～1×109CFU/mL，然後取菌懸液1 mL，加入有機干擾物1 mL，混勻，取10 μL滴染於滅菌載體上，於37℃培養箱或室溫自然乾燥即可。活菌培養計數結果回收菌數應滿足1×106CFU/片～5×106CFU/片。
9 6 龜分枝桿菌膿腫亞種定量殺滅試驗
9.1 6.1 試驗分組
6.1.1 試驗組，即預先設定的消毒劑量組，即選定消毒劑濃度與作用時間。
6.1.2 陽性對照組，以標準硬水代替消毒劑溶液，按照試驗組相同的規定和程序進行試驗。所得結果代表試驗體系中所含受試菌的初始濃度，並以其計算消毒因子對受試菌的殺滅對數值。
6.1.3 陰性對照組，觀察同次試驗用相關試劑和培養基有無污染。
9.2 6.2 試驗程序
9.2.1 6.2.1 懸液定量殺滅試驗
6.2.1.1 用標準硬水將消毒劑稀釋成試驗濃度的1.25倍，置20℃±1℃水浴待用。
6.2.1.2 試驗組，於無菌大試管中加入0.5 mL試驗用菌懸液，再加入0.5 mL有機干擾物質，混勻，20℃±1℃水浴5 min後，用無菌吸管吸取上述稀釋的消毒劑溶液4.0 mL注入其中，迅速混勻並立即計時。待作用至各預定時間，分別吸取0.5 mL試驗菌與消毒劑混合液加於4.5mL經滅菌的中和劑中，混勻作用10 min，然後按照6.2.3進行活菌培養計數。
6.2.1.3 陽性對照，用標準硬水代替消毒劑按試驗組方法試驗，作爲陽性對照。6.2.1.4 根據活菌培養計數結果，按照6.3計算殺滅對數值。
9.2.2 6.2.2 載體定量殺菌試驗
主要用於原液使用的液體化學消毒劑、黏稠的消毒劑和原液直接沖洗用的消毒劑對分枝桿菌消毒效果的評價。
6.2.2.1 將消毒劑置20℃±1℃水浴待用。
6.2.2.2 試驗組，每個消毒劑量，取1片菌片，按每片染菌載體使用5.0 mL加入消毒劑溶液，在20℃±1℃條件下，待消毒作用至預定時間，立即用無菌鑷子將染菌載體取出，移人含5.0 mL中和劑的試管中，電動混合器混合20 s，或將試管在手掌上振打80次。然後按照6.2.3的方法進行活菌培養計數。
6.2.2.3 陽性對照，用滅菌稀釋液代替消毒劑按試驗組方法試驗，作爲陽性對照。
6.2.2.4 根據活菌培養計數結果，按照6.3計算殺滅對數值。
平皿傾注法：取1.0 mL分枝桿菌懸液（或菌片洗脫液）的適宜稀釋倍數稀釋液，加於滅菌平皿中，傾注經加熱融化並冷卻到45℃～50℃的商品化分枝桿菌專用複合瓊脂培養基，每皿約25 mL～30 mL，旋轉混勻。待冷卻凝固後，放入乾淨的塑料袋內，37℃培養箱培養7d，觀察並計數菌落數。
9.3 6.3 殺滅對數值的計算
按式（1）計算殺滅對數值（KL）。
KL=lgN0- lgNx ……………（1）
式中：
10 7 評價規定
按產品使用說明書指定的使用濃度（強度）和作用時間，試驗重複3次，應符合GB 15981要求。懸液定量殺滅試驗中各次試驗的殺滅對數值均≥4.00，載體定量殺滅試驗中，各次試驗的殺滅對數值均≥3.00，可判定該產品對分枝桿菌污染物消毒合格。
11 附錄A（規範性附錄）培養基
11.1 A.1 改良羅氏培養基
11.1.1 A.1.1 成分
改良羅氏培養基成分見表A.1。
表A.1 改良羅氏培養基成分
11.1.2 A.1.2 製法
各鹽類成分溶解後，加馬鈴薯澱粉，混勻，沸水鍋內煮沸30 min～40 min（其間不時搖動，防凝塊），呈糊狀，待冷後，加入經消毒紗布過濾的新鮮全卵液1000 mL，混勻。加2%孔雀綠20 mL，混勻，分裝試管（18 mm×180 mm），每一試管加培養基7 mL，培養基斜面高度爲培養基佔試管底部的三分之二處爲宜；若製作培養基平皿，則每皿（Φ=9 cm）加約30 mL～35 mL，置血清凝固器內凝固。
凝固器內溫度至90℃後，放入分裝好的培養基試管或平皿，以擺放兩層爲宜。待凝固器內溫度達85℃～90℃，計時，凝固1 h～1.5 h後取出，放冷，無菌試驗後放4℃冰箱備用，一個月內使用。
注：製備的培養基顏色鮮豔，表面光滑溼潤，無氣泡，有一定韌性和酸鹼緩衝能力。
11.2 A.2 標準硬水（硬度342 mg/L）
稱取0.304 g氯化鈣（CaCl2）和0.139 g氯化鎂（MgCl2·6H2O），用1000 mL蒸餾水溶解後即成。
11.3 A.3 有機干擾物
a）對未清洗物品的消毒效果評價時：稱取30 g牛血清白蛋白，溶於1000 mL蒸餾水中，待完全溶解後用微孔濾膜（孔徑爲0.45μm）濾過除菌，4℃冰箱保存。
b）對清洗過物品的消毒效果評價時：稱取3g牛血清白蛋白，溶於1000 mL蒸餾水中，待完全溶解後用微孔濾膜（孔徑爲0.45 μm）濾過除菌，4℃冰箱保存。
11.4 A.4 磷酸鹽緩衝液（PBS，0.03 mol/L，pH7.2）
稱取2.83 g無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）和1.36 g磷酸二氫鉀（KH2PO4），加入到1000 mL蒸餾水中，待完全溶解後，調pH至7.2～7.4，於121℃壓力蒸汽滅菌20 min。
11.5 A.5 0.1%胰蛋白腖生理鹽水溶液（TPS）
稱取1.0g胰蛋白腖、8.5 g氯化鈉，用950 mL以上蒸餾水溶解，並調節pH值在7.0±0.2，補加蒸餾水至1000 mL，分裝後，經121℃壓力蒸汽滅菌。
11.6 A.6 蘇通（Sauton）綜合液體培養基
11.6.1 A.6.1 成分
11.6.2 A.6.2 製法
上述成分加熱溶解後，用氨水調節pH至7.2，過濾、分裝，121℃滅菌20 min，冰箱保存備用。
11.7 A.7 營養肉湯培養基
11.7.1 A.7.1 成分
蛋白腖 10.0 g 牛肉膏3.0 g
11.7.2 A.7.2 製法
12 附錄B（規範性附錄）中和劑鑑定試驗方法
12.1 B.1 目的
12.2 B.2 實驗器材
B.2.2 刻度吸管（0.1 mL、1.0 mL、5.0 mL）或移液器。
B.2.3 平皿。
B.2.4 恆溫水浴箱。B.2.5 稀釋液。
12.3 B.3 試驗設計原則
B.3.1 試驗中所用的消毒劑濃度應以殺菌試驗中使用的最高濃度爲準。
B.3.2 所用實驗方法應與殺菌試驗方法一致，或用懸液或用載體定量試驗。
12.4 B.4 實驗分組
至少應平行進行以下各組試驗：
觀察中和產物和未被完全中和的殘留消毒劑對試驗分枝桿菌是否有抑菌作用。
c） 稀釋液+菌液或菌片→培養
作爲菌懸液（菌片）陽性對照。
d）稀釋液+中和劑→培養
作爲試驗材料陰性對照。
12.5 B.5 操作程序
12.5.1 B.5.1 中和劑懸液定量鑑定試驗程序
根據試驗分組，準備足量的試管和平皿，並依次進行編號。將菌懸液用等量適用濃度的有機干擾物稀釋成2.5×103CFU/mL～1.5×104CFU/mL，作爲試驗菌懸液。
第一組 取0.4 mL標準硬水於試管中，加入4.5 mL中和劑，混勻，置20℃±1℃的水浴中5 min後，加入0.1 mL菌懸液，混勻，作用10 min後，分別取1.0 mL接種兩個平皿，做活菌培養計數。
第二組 取0.4 mL消毒劑於試管中，加入4.5 mL中和劑，混勻，置20℃±1℃的水浴中5 min後，加入0.1 mL菌懸液，混勻，作用10 min後，分別取1.0 mL接種兩個平皿，做活菌培養計數。
第三組 取0.4 mL標準硬水於試管，加入4.5 mL稀釋液，混勻，置20℃±1℃的水浴中5 min後，加入0.1 mL菌懸液，混勻，作用10 min後，分別取1.0 mL接種兩個平皿，做活菌培養計數。
第四組 取標準硬水、稀釋液、中和劑各0.5 mL，接種於同一無菌平皿，傾倒入實驗同批次的培養基15 mL～20 mL，培養觀察。
12.5.2 B.5.2 中和劑載體定量鑑定試驗操作程序
根據試驗分組，準備足量的試管和平皿，並依次進行編號。將菌懸液用等量適用濃度的有機干擾物稀釋成5×103CFU/mL～1×104CFU/mL，然後取10 μL滴染無菌載體，於37℃培養箱或室溫自然乾燥。
第一組 取5.0 mL中和劑於試管中，置20℃±1℃的水浴中5 min後，用無菌鑷子取一片菌片放入試管中，作用10 min。用電動混合器混合10 s或將試管振打80次，混勻，分別取1.0 mL接種兩個平皿，做活菌培養計數。
第二組 取5.0 mL中和產物（以浸有消毒劑的載體置5.0 mL中和劑內，作用10 min）於試管中，置20℃±1℃的水浴中5 min後，用無菌鑷子取一片菌片放入試管中，作用10 min。用電動混合器混合10 s或將試管振打80次，混勻，分別取1.0 mL接種兩個平皿，做活菌培養計數。
第三組 取5.0 mL稀釋液於試管中，置20℃±1℃的水浴中5 min後，用無菌鑷子取一片菌片放入試管中，作用10 min。用電動混合器混合10 s或將試管振打80次，混勻，分別取1.0 mL接種兩個平皿，做活菌培養計數。
第四組 分別吸取稀釋液和中和劑各1.0 mL，接種於同一無菌平皿，傾倒入實驗同批次的培養基15 mL～20 mL，培養觀察。
12.6 B.6 評價規定
B.6.1 第一、二、三組有相似菌量生長，懸液試驗在2.5×103CFU/mL～1.5×104CFU/mL，載體試驗在2.5×102CFU/片～1.5×103CFU/片，且組間菌落數誤差率不應超過15%。組間菌落數誤差率（%）按式（B．1）計算：
B.6.3 連續3次取得合格評價的中和劑方可用於正式殺滅試驗。